宁波猫的窝

伪彩和校准尺（Calibration bar）是清晰明确地展示图像数据的重要工具。

伪彩（Pseudo-color）图像，其本质是仅具有单个通道的灰度图像，通过“查找表”（Look Up Table，LUT），根据灰度值分配给每个像素以颜色，从而呈现彩色。

伪彩反映的是灰度值的差异，而不是已成像样本的颜色差异：

▲T1结构图，左侧为原始灰度图，右侧加了Fire样式的伪彩

▲树叶RGB图片，可以分为RGB三个通道

伪彩本质是把灰度值与颜色之间做一个映射，不同的Look Up Table（LUT），具有不同的映射关系，可以通过 Image -> Color -> Display LUTs 查看：

▲Fiji自带的LUT

这种映射关系通常可以通过Calibration bar展示出来，从而清晰表明图像颜色与数值之间的关系，如下图所示，0~255的灰度值，根据LUT的不同，可以对应不同颜色：

▲常用的几种LUT

这篇文章会介绍怎样为图片增加伪彩以及Calibration Bar，以及添加伪彩时的注意事项。

以绿色通道的神经元图片为例，为图像增加Fire样式的伪彩以及Calibration Bar：

需要注意的是，这里的图片虽然呈现绿色，但本质是8-bit的

1、打开图片，如果是RGB图片，转成灰度图（8-bit 或 16-bit）

2、选择LUT（Image -> Lookup Tables，或者点击工具栏LUT）

这里选择Fire样式

3、添加Calibration bar（Analyze -> Tools -> Calibration Bar）

这里有很多可以调整的参数，多试一试就知道每一个参数代表的意义：

这里需要注意是否要勾选Overlay，如果勾选Overlay，则属于非破坏性的标注，需要再Flatten印在图片上；如果不勾选Overlay，则属于破坏性的标注，直接印在图片上。

其他的参数可以参考Calibration Bar的官网说明：

https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#cbar

当然Calibration Bar的位置可以自定义，用矩形工具选取出想要添加的区域，Calibration Bar就会出现在选取区的位置上：

点击OK后，即可生成新的带有Calibration Bar的图片，注意这时候的图片是RGB格式：

文献中常常会遇到这类Calibration Bar，数值并不代表灰度，而代表比值。

添加这类Calibration Bar时，需要先对原本图像的灰度值做一次校正/映射（Analyze -> Calibrate）：

这里假定灰度和数值之间是线性关系（Straight Line），灰度值0对应0，灰度值255对应1：

左侧填灰度值，右侧填校正值

▲校正后的线性方程

Calibrate之后，再添加Calibration Bar，即可看到上限和下限变成了1和0：

One more thing，文献中关于伪彩的配色通常会将红绿色，替代为品红色（magenta）和青色（cyan），以增强色盲对图片的识别。

在ImageJ中，可以将红色和绿色通道分别提取出来，然后以magenta和cyan样式的伪彩Merge channel：

或者通过（Image -> Color -> Replace Red with Magenta）一键替换：